介紹：

每種化合物都能吸收一定波長的光，電子散射或反射表面。其濃度值可反映為光譜儀變化的抗壓強(qiáng)度。分光光度計(jì)是用來準(zhǔn)確測(cè)量通過樣品吸收特殊波長光的光量子量。

基本原理：

根據(jù)光源的波長，分光光度計(jì)可分為紫外線-能見光分光光度計(jì)和紅外分光光度計(jì)。-能見光分光光度計(jì):紫外線股票波段(185~400 nm），能見光股票波段(4000)-700 nm）紅外分光光度計(jì):紅外股票波段(7000~1,5000 nm）

分光光度計(jì)設(shè)備結(jié)構(gòu)

Fig1:分光光度計(jì)基本結(jié)構(gòu)（by Heesung Shim）

詳細(xì)的基本原理：

燈源引起光，看準(zhǔn)儀（ps濾鏡通過單色儀（三棱鏡）將光聚集分為多個(gè)重量的波長（光譜儀），然后根據(jù)波長選擇符（雙縫）傳輸必要的波長。特殊波長I0光通過樣品后，會(huì)被吸收成部分It。檢查分光光度計(jì)It根據(jù)計(jì)算，將數(shù)據(jù)信號(hào)發(fā)送到數(shù)顯計(jì)數(shù)器。不同的化學(xué)物質(zhì)有不同的最佳方法OD比如硝基酚(酸法)在320 nm硝基苯酚鹽(堿法)具有最佳吸光值，400 nm吸光度值最好。

Fig2: 硝基酚和硝基酚鹽的光吸收值。

Fig2: 硝基酚和硝基酚鹽的光吸收值。

計(jì)算方法

當(dāng)光通過比色皿和樣品時(shí)，部分光被吸收，光的吸收與樣品濃度值呈線性相關(guān)。I0和It精確測(cè)量，使用比爾-蘭伯特基本定律(Beer-Lambert law)樣品的濃度值可度值。

Fig3. 光電子散射平面圖。（by Heesung Shim）

光吸收值：

比爾-蘭伯特基本定律：

A:精確測(cè)量的光吸收值。又被稱為光密度“OD”值。ε：摩爾吸光系數(shù)。l:光在樣品中一路走來徑長短。c: 樣品濃度值。每個(gè)主要參數(shù)和含義:Dna240~290 nm紫外線具有明顯的吸收值。260 nm最高吸收值為230 nm有吸收低谷期。蛋白質(zhì)含有280 的芳香碳水化合物nm吸收值最高。鹽和小分子水的吸收值集中在230 nm處。純度分析：

高純：

DNA：A260/A280 1.8~1.9; A260/A230 >2.0RNA：A260/A280 1.9~2.0; A260/A230 >2.0RNA的A260/280參考值比DNA這是因?yàn)閴A基較高U的A260/280的參考值高于堿基T的A260/280比例較高。

出現(xiàn)異常：

A260/A280>1.9：RNA很有可能沒有去掉A260/A280<1.8: 含酚或蛋白質(zhì)A260/A230<2.0: 殘留鹽或小分子水的常見環(huán)境污染問題:紫外光相色譜法能很好地區(qū)分嗎？DNA和RNA中間的環(huán)境污染應(yīng)根據(jù)電泳原理進(jìn)行評(píng)估。A260/A280=1.也許是蛋白質(zhì)和RNA同時(shí)，環(huán)境污染可根據(jù)電泳原理進(jìn)行評(píng)估RNA，或者分析圖形，看A280 nm吸收光值來區(qū)分蛋白質(zhì)環(huán)境污染。A260/A樣品將遭受280的影響PH以及離子濃度的危害。為了更好地確保準(zhǔn)確的測(cè)量，請(qǐng)?jiān)跇悠菲』驔_洗時(shí)使用相同的緩沖溶液。樣品濃度值過低或過高可能會(huì)影響精度。注意實(shí)際操作，樣品應(yīng)混合對(duì)稱，無氣泡。論文參考文獻(xiàn)："Spectrophotometry". LibreTexts"Nanodrop經(jīng)驗(yàn)之談". 于浩然. 科學(xué)網(wǎng)博客"260/280 260/230". 湯強(qiáng). 科學(xué)網(wǎng)博客"OD值和OD值值". Zmj0630. 丁香園D值和吸光值". Zmj0630. 丁香園氣相色譜法測(cè)試酸濃度值

香園

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